bbin宝盈集团

本文以bbin宝盈集团生物的实际项目案例为基础，详细介绍了DNA pull down实验的流程，共分为三大块的内容，包括实验所需的仪器试剂、实验方法及实验结果的解析，仅供参考。

试剂和耗材
样品：1个样品
TaKaRa Ex Taq：TaKaRa	Biotin-11-dUTP
dATP/dTTP/dCTP/dGTP	NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents：Thermo fisher
BCA Protein Quantification Kit	Bioeast Mag-SA
DL2000 DNA Marker：TaKaRa	VAHTS DNA Clean Beads
Protein Marker：Thermo	Acr、Bis、Tris：Sigma公司
SDS：Amresco	TEMED：BIO-RAD
快速银染试剂盒	其它试剂均为国产分析纯。

主要实验仪器
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机：美国BECKMAN公司	台式高速离心机：德国SORVAL公司
Mini Protean II垂直平板电泳系统：美国BIO-RAD公司	320-S pH计：美国Mettler Toledo公司
AR5120电子天平：美国AHOΜS公司	雪花状制冰机：日本SANYO公司
超净工作台：中国苏净集团	梯度PCR仪：TP600型，TaKaRa公司
离心机：Sigma 1-14型，Sartorius公司	电泳仪：TY2795型，BIO-RAD公司
电泳槽：Sub-Cell GT Cell，BIO-RAD公司	凝胶成像分析系统：GelDocXR型，BIO-RAD公司
移液器：2.5 µl/100 µl/200 µl/1000 µl，Eppendorf公司

实验方法及结果

1、探针制备

采用PCR制备探针

引物序列：
F：5' CTATCCGGCCCAAGCTTT 3'
R：5' AATAATTCACCTTGGTGTAAC 3'（728 bp）

PCR反应体系如下：

表1 PCR反应体系     Table 1 PCR reaction system
成分	体积
10× Ex Taq Buffer（Mg 2+ plus）	5 μL
dUTP标记混合物	4 μL
F	1 μL
R	1 μL
DNA	＜500 ng
TaKaRa Ex Taq	0.25 μL
ddH2O	Up to 50 μL

PCR反应程序如下：

表2 PCR反应程序     Table 2 PCR reaction procedure
反应温度	作用	反应时间
94℃	预变性	5 min
94℃	变性	30 s	30个循环
58℃	退火	30 s
72℃	延伸	50 s
72℃	复性	7 min

标记探针电泳分析

标记后PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，探针成功标记后分子量增加，电泳条带滞后。结果如下所示：

图1 探针电泳检测
Fig.1 Evaluation of PCR-labeled probes by electrophoresis
Lane M：DL2000 Plus DNA Marker
（从上到下：2000，1000，750，500，250，100）
Lane 1：Biotin-11-dUTP标记的探针
Lane 2：对照的DNA探针

采用VAHTS DNA Clean Beads 对PCR产物回收，待用。

2、核蛋白的提取

(1)对于贴壁细胞，用胰蛋白酶EDTA收获，然后以500×g离心5分钟。对于悬浮细胞，顺利获得500×g离心5分钟取得；
(2)用PBS悬浮细胞颗粒，清洗细胞；
(3)将1×106细胞转移至1.5 mL离心管中，以500×g离心2-3分钟；
(4)使用移液枪小心吸取并丢弃上清液，使细胞沉淀尽可能干燥；
(5)采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Thermo fisher，货号78833）提取核蛋白，加入CER I，涡旋使细胞完全悬浮，将离心管在冰上孵育10分钟；
(6)向管中添加预冷CER II，涡旋5s，将离心管在冰上孵育1分钟；
(7)涡旋5s，在离心机（16000×g）中以最大速度离心5分钟，去上清；
(8)沉淀加入NER，充分悬浮，涡旋15秒后将样品放在冰上，每10分钟涡旋15秒，总共40分钟；
(9)在离心机中以最大速度（16000×g）离心10分钟；
(10)立即将上清液（核蛋白提取物）部分转移到干净的预冷离心管中，放在冰上；
(11)在使用前，储存在-80℃。
采用BCA法检测蛋白浓度。

3、探针与蛋白互作

实验具体分组如下：

编号	1	2	3	4	5
探针	+	-	+	-	-
Biotin-11-dUTP标记探针	-	+	-	+	-
核蛋白	-	-	+	+	+
Bioeast Mag-SA	+	+	+	+	+

(1)预先混合1 µg DNA探针和70 µg核蛋白，置于冰上；
(2)取50 µl Bioeast Mag-SA，用冰冷PBS洗一次，5000×g 离心30秒； 
(3)将DNA与蛋白的混合物加到Bioeast Mag-SA中，重悬珠子； 
(4)4℃孵育1小时；
  (5)5000×g，离心30秒，去除上清，收集沉淀； 
(6)用冰冷PBS洗Bioeast Mag-SA三次，5000×g 离心1分钟，尽可能去除上清，收集沉淀；
(7)加入30 µl蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮10分钟。

4、SDS-PAGE检测

(1) 样品制备：样品中加入Loading Buffer，100°C 10 min。
(2) 电泳条件：5%浓缩胶：90 V，30 min；10%分离胶：120V，90 min。
(3) 电泳结束后进行银染，拍照记录跑胶图片用于分析。

5、实验结果

图2 SDS-PAGE检测分析图
Fig.2 SDS-PAGE detection analysis
Lane M: Protein Marker
Lane 1: 探针+Bioeast Mag-SA
Lane 2: Biotin-11-dUTP标记的探针+Bioeast Mag-SA
Lane 3: 探针+Bioeast Mag-SA+核蛋白
Lane 4: Biotin-11-dUTP标记的探针+Bioeast Mag-SA+核蛋白
Lane 5: Bioeast Mag-SA+核蛋白

顺利获得SDS-PAGE银染结果检测，发现Biotin-11-dUTP标记的探针与核蛋白有明显互作，如需要进一步确认，建议进行后续的LC-MS鉴定。

以上分析仅供参考。

6、质谱检测

(1)检测对象

序号	编号	样本类型	物种
1	Control	Pull-down溶液	Ovis aries
2	sample	Pull-down溶液	Ovis aries

(2)检测过程

略

(3)检测结果

样品名称	Control	sample	差异蛋白
Protein Group	230	327	132

7、生物信息学分析

针对实验组扣除对照组后的132个差异蛋白进行生物信息学分析（GO、KEGG pathway、String）。

(1)GO分析

根据分类结果，对包含目标蛋白最多的前20位GO条目作出统计图，不同颜色代表三个不同的本体，柱形代表该条目包含的目标蛋白数量。

图3、GO功能分类图示例

(2)KEGG pathway分析

在通路图中，绿色底为该物种中包含的蛋白，红色底为本项目的目标蛋白。不同节点间用不同连线表示不同含义。

图4、KEGG通路图示例

图5、节点间的各种关系

根据Pathway条目信息表数据，对包含目标蛋白最多的前20位pathway作分类图，柱形代表该条目包含的目标蛋白数量。

图6、KEGG pathway分类图示例

(3)String蛋白质互作网络分析

在蛋白关联网络图中，蓝色的连线表示蛋白间的联系，根据蓝色深度不同，相互作用可信度的强度也不同，颜色越深，可信度越强。

图7、String分析图

8、输出文件

输出文件	文件内容
体外转录和纯化	PCR产物琼脂糖电泳分析 转录产物琼脂糖电泳分析；
DNA pull down	SDS-PAGE图
LC-MS/MS	检索结果表格.xlsx 差异蛋白表格.xlsx
生物信息学分析	GO功能注释和分类 KEGG Pathway通路注释和分类 String蛋白质互作网络分析

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