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3.1采用PCR扩增探针序列

引物序列：
24853正义链F1: 5'-GgcTAAT·····省略······TCGCGCCGCTGTGT -3'
24853正义链R1: 5'-AAAGCCTC···省略·····TCCCAAC -3'
24853正义链F2: 5'-GgcTAA···省略·····CTGGGGTTAT -3'
24853正义链R2: 5'-AGTCT···省略·····ACC -3'
24853正义链F3: 5'-GgcTA···省略·····AGAGCAAG -3'
24853正义链R3: 5'-ACAA···省略·····TT -3'
24853反义链F1: 5'- CTCT···省略·····AG-3'
24853反义链R1: 5'-GgcTAA···省略·····TGTT -3'
24853反义链F2: 5'- CCTC···省略·····TTAT-3'
24853反义链R2: 5'- GgcTAAT···省略·····ACC-3'
24853反义链F3: 5'- GTGACT···省略·····GTGT-3'
24853反义链R3: 5'- GgcT···省略·····AAC-3'

3.2 PCR扩增制备DNA片段

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

PCR反应产物进行电泳跑胶，采用磁珠方式回收目标条带。

4.1 体外转录合成RNA

（1）根据如下体系配置反应液，轻柔混匀。

（2）37-42℃静置2 -4h，孵育结束后，加入1μl TURBO DNase，37-42℃静置15 min 去除DNA模板。

4.2 RNA纯化

（1）加入1/10体积的3M 醋酸钠，充分混匀。
（2）加入等体积的1:1的酚/氯仿，进行混合。
（3）12000 rpm，4℃，5 min。
（4）小心将上清液转移到另一个微量离心管，注意不要吸到中间的变性蛋白质层。
（5）加入2倍体积的无水乙醇，-80℃静置30 min。
（6）12000 rpm，4℃，25 min，弃上清。
（7）加入70-80%的乙醇（室温）1 ml，轻轻倒转2-3次进行混匀。
（8）12000 rpm，4℃，5 min。
（9）弃上清液。
（10）离心沉淀RNA，用移液器完全吸掉乙醇溶液。
（11）加入适量的Nuclease-Free water，用移液器上下吹打使沉淀溶解。

4.3 RNA检测

进行琼脂糖凝胶电泳，结果如下：

5.1 蛋白的提取

(1)对于细胞，用胰蛋白酶EDTA收获，然后以500×g离心5分钟。对于悬浮细胞，顺利获得500×g离心5分钟取得；
(2)用PBS悬浮细胞颗粒，清洗细胞；
(3)将1×107细胞转移至1.5 mL离心管中，以500×g离心2-3分钟；
(4)使用移液枪小心吸取并丢弃上清液，使细胞沉淀尽可能干燥，液氮冻干后，研磨棒迅速研磨；
(5)采用Pierce™ IP 裂解缓冲液提取蛋白，加入cOmplete ULTRA Tablets，Mini，蛋白酶抑制剂混合物，涡旋使细胞完全悬浮，将离心管在冰上裂解15分钟；
(6)在离心机中4℃（16000×g）以最大速度离心20分钟，收取上清；
(7)在使用前，储存在-80℃。
采用BCA法检测蛋白浓度。

5.2 探针与蛋白互作

实验具体分组如下：

(1)取适量 Bioeast Mag-SA，用冰冷PBS洗三次，置于磁力架上分离磁珠和液体，小心的移去上清； 
(2)预先分别混合1 µg RNA探针和50 µl Bioeast Mag-SA，400µg蛋白和50 µl Bioeast Mag-SA，置于4℃孵育1小时；
(3)取孵育后蛋白（去磁珠），将蛋白加到RNA探针和Bioeast Mag-SA的混合物中，重悬珠子； 
(4)4℃孵育1小时；
  (5)置于磁力架上分离磁珠和液体，小心的去除上清，收集磁珠；
  (6)用冰冷PBS洗Bioeast Mag-SA三次，置于磁力架上分离磁珠和液体，尽可能去除上清，收集磁珠；
(7)加入40 µl蛋白上样缓冲液，重悬沉淀，沸水煮10分钟。

5.3 SDS-PAGE检测

(1) 样品制备：样品中加入Loading Buffer，100°C 10 min。
(2) 电泳条件：5%浓缩胶：90 V，30 min；10%分离胶：120V，90 min。
(3) 电泳结束后进行银染，拍照记录跑胶图片用于分析。

实验结果

图3 SDS-PAGE检测分析图
Fig.3 SDS-PAGE detection analysis
Lane M: Protein Marker
Lane 1: 标记正义链探针+Bioeast Mag-SA+蛋白
Lane 2: 标记反义链探针+Bioeast Mag-SA+蛋白
Lane 3: Bioeast Mag-SA+蛋白

顺利获得SDS-PAGE银染结果检测，发现Biotin-11-dUTP标记的探针与核蛋白存有明显互作，如需要进一步确认，建议进行后续的LC-MS鉴定。

以上分析仅供参考。